随着2011年美国食品及药物管理局(FDA)批准的首个免疫检查点抑制剂(ICIs)Ipilimumab 的上市,开启了ICIs用于临床抗 肿瘤治疗的新纪元,是肿瘤免疫 治疗的革命性里程碑。免疫检查点是指免疫细胞在维持免疫耐受过程中为调节和控制免疫应答的持久性而具有的一系列抑制通路。而肿瘤细胞又恰好可以通过激活免疫检查点通路抑制抗肿瘤免疫应答。因此,ICIs主要就是通过抑制 T 细胞介导的这种抑制性 免疫应答,促进免疫介导的肿瘤细胞清除。目前,ICIs 主要分为两类:一类是靶向细胞毒性T淋巴细胞抗 原-4(CTLA-4)的抗体,另一类是靶向程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)及其配体程序性死亡受 体 配 体-1 (PD-L1)的抗体。尽管ICIs疗法可以为一部分患者提供持久的治疗效果,但一部分患者会发生耐药,而 另一部分患者会出现自身免疫样毒性,也就是免疫相关不良事件(irAEs)。耐药可以分为两大类:一类是原发性耐药,患者对ICIs没有任何反应并且肿瘤进展 迅速;另一类是获得性耐药,患者最初对ICIs治疗有 反应,但最终出现临床和/或放射学上的疾病进展。而irAEs可以发生在皮肤、甲状腺、胃肠道、肝、肺等任何器官,根据恶性肿瘤的类别、ICIs的种类和易感 性而存在个体差异,严重者会出现肿瘤暴发性进展甚至死亡。。因此,寻找能够判断ICIs疗效、耐药,预测和诊断irAEs的生物标志物亟不可待。

1.1.1 CTLA-4 类抗体的作用机制    首个被美国FDA批准上市的ICIsIpilimumab就是靶向 CTLA-4 的抗体,主要用于黑色素瘤的治疗。CTLA-4,又 名 CD152,仅由 T 细胞 表 达。在 静 止 的 T 细 胞 中, CTLA-4是一种胞内蛋白,当主要组织相容性复合物 (MHCs)与 T 细 胞 受 体 (TCRs)结 合,共 刺 激 受 体 CD28与配体 CD80(B7.1)和 CD86(B7.2)结 合 后, CTLA-4转 移 到 细 胞 表 面,竞 争 性 地 与 共 刺 激 因 子 CD80/CD86结合,介导抑制性信号进入 T 细胞,从而 阻止 T 细胞增殖和活化。与 CD28相比,CTLA-4与 CD80/86配体的亲和力更高。因此,CTLA-4可以 在淋巴结免疫应答的早期控制 T 细胞的增殖和活化。不同于效应 T 细胞(Teff),调节性 T 细胞(Treg)构成 性表 达 CLTA-4,在 炎 性 刺 激 时,抗 原 提 呈 细 胞 (APCs)上 调 CD80/CD86 的 表 达,减 弱 Treg 表 面 CTLA-4对 CD28的竞争性抑制,从而激活共刺激信 号,促进 T 细胞增殖,增强炎症免疫应答。而在肿瘤 微环境(TME)中,CD80/CD86受 Treg的控制,大量 的 Treg 抑 制 免 疫 应 答。而 CTLA-4 抗 体 具 有 比 CD80/CD86更 高 的 CTLA-4 亲 和 力,其 与 CTLA-4 结合可使 Treg耗竭或功能性阻断。CTLA-4抗体还 可以防止 APCs跨内吞作用,增加其表面CD80/CD86 的表达,并通过表达 FcR-Ⅳ肿瘤内巨噬细胞介导的直 接 Treg毒性和抗体依赖性细胞毒性,增强 T 细胞活 化和抗肿瘤免疫应答。

1.1.2 PD-1/PD-L1类抗体的作用机制  PD-1在活化的T细胞，B细胞和自然杀伤(NK)细胞上均有表 达,并且是外周组织后期抗肿瘤免疫的重要组成之一。PD-1，又名 CD274,是 B7/CD28共刺激受体 家族中的成员,通过与配体 PD-L1和 PD-L2结合来 抑制 T 细胞活化,维持免疫稳态。PD-L1在多种 肿瘤细胞中高表达,并且在 TME 中,宿主树突状 细胞(DC)、巨噬细胞、成纤维细胞及 T 细胞中也表达 PD-L1,从而抑制抗肿瘤免疫。此外,PD-L1的表 达还受JAK2、STAT 等基因转录信号通路,转录 后和翻译后修饰以及外泌体转运等的调控。用抗体阻断 PD-1受体或其配体 PD-L1可重新激活 TME中耗竭的免疫细胞并消除癌细胞,增强抗肿瘤 免疫活性;还能降低 PD-L1驱动的非免疫检查点功 能,减弱 DNA 损伤反应和修复。并且,通过抗体 下调 APC和 DC上的 PD-L1表达还可以提高对ICIs 联合疗法的反应率。 

1.2 ICIs耐药的机制     目前,对ICIs耐药机制的研 究依赖于临床前研究和相关的临床数据。而由于 缺乏对ICIs长期治疗疗效和临床反应相关的临床、分子、免疫学因素的认识,ICIs治疗相关的原发性和获 得性耐药机制也尚未完全阐明。但已明确,ICIs耐药 往往与抗原加工和呈递中的体细胞突变,与 细 胞 黏 附、血 管 生 成和 细 胞 外 基 质 重 塑 有 关 的 基 因 上 调,以及一些信号通路的改变有关。其中,原发性 耐药的 机 制 包 括 抗 原 突 变、肿 瘤 抗 原 表 达 缺 失、 HLA 表达缺失、抗原加工机制改变,以及 T 细胞 功能不全。T 细胞功能不全包括与 MAPK、PTEN/ PI3K、WNT/β-catenin和 BRAF等致癌基因 信号和组成性 PD-L1表达改变有关的遗传性 T 细 胞抵抗,与IFN-γ信号通路突变有关的 T 细胞不敏 感,由 Treg/Teff比例失调引起的 T 细胞抑制功能失 调和肿瘤特异性 TCRs缺乏的 T 细胞缺乏。而目前 对继发性耐药机制的研究还较少,但类似于原发性耐 药,其机制同样也包括靶抗原、HLA 丧失,干扰素信 号改变及 T 细胞功能丧失。但又不同于原发性耐药 患者中β2-微球蛋白(β2-MG)缺失引起的 MHCⅠ类 抗原提呈缺失,大多数具有β2-MG 突变和蛋白表达 缺失的患者仍然对ICIs敏感,不表现为继发性耐药, 提示虽然原发性耐药和继发性耐药的表型机制相似, 但其根本机制有本质区别,有待进一步探索。 

1.3 irAEs的机制     irAEs的机制尚未完全明确,但 可以肯定其机制与其相应药物的治疗机制基本一致。其潜在机制主要包括针对肿瘤和健康组织中抗原的 T细胞活性增加,之前存在的自身抗体水平增加以及 炎症细胞因子表达上升。有研究发现,在1例患者的 心肌和肿瘤中有类似的 T 细胞克隆,提示在正常 组织中,针对肿瘤的 T 细胞与针对相关抗原的 T 细 胞之间存在交叉反应,T 细胞抗肿瘤活性增加的同 时可能也会攻击正常的组织细胞,导致细胞介导的组 织损伤。同时,ICIs可能重新激活原本处于休眠状态 的自身反应性 T 细胞,导致 T 细胞对肿瘤抗原和自 身抗原的耐受性下降,自身反应性 B细胞活化并最终 形成自身抗体,引起irAEs,但目前仍缺乏irAEs患者 自身抗体表达差异的前后对照研究。T 细胞活化必 然会引起炎症因子表达增加,炎症因子的级联放大在 irAEs的发生发展中也发挥了重要作用。虽然 CT- LA-4通路与 PD-1/PD-L1 通路存在一些相似之处, 但其本质不同。因此,其机制也因ICIs种类而各有侧 重。CTLA-4抗体侧重于破坏稳态外周的阴性选择, 促进了新的自我反应性 T 细胞的发育,而 PD-1主要 激活转录因子,改变耗竭 T 细胞的表观基因,导致其 重新激活并增加了攻击自 身 组 织 的 可 能 性。并 且, CTLA-4抗体可以直接与垂体等正常组织的 CTLA-4 结合,增强补体介导的细胞毒作用。特定irAEs可 能涉及不同的病理生理学机制,需要具体问题具体分 析。而遗传学、免疫系统状态 以 及 如 宿 主 微 生 物 组 学、肠道菌群等的其他环境因素在irAEs中的作用仍 不清楚,还有待进一步了解。

2.1 评估ICIs疗效的生物标志物    ICIs疗效与肿瘤 基因组学、宿主遗传学以及与免疫微环境(IME)有关 的PD-L1表达、淋巴细胞表型、炎症因子表达等有关。肿瘤种类不同,免疫检查点的应用不同,ICIs引起的 免疫应答也不同。并且ICIs药物史会影响生物标志 物的预测效力,但并不会影响药物的疗效。 

肿瘤基因组学的生物标志物主要通过基因突变 影响 T 细胞对肿瘤细胞的识别来评估ICIs的疗效。与ICIs疗效呈正相关的潜在肿瘤基因组学相关的生 物标志物包括肿瘤突变负荷(TMB)、MHCs特异的 亲和力指数(DAI)、错配修复缺陷(MMRd)和插入缺 失突变。与ICIs疗效呈负相关的潜在肿瘤基因组学 相关的生物标志物包括 CTLA-4抗体耐药相关的黑 色素瘤相关抗原(CRMA)、肿瘤内的异质性(ITH)和 体细 胞 拷 贝 数 改 变 (SCNAs)。另 外,研 究 表 明 BRAF、PBRM1缺失突变与 PD-1抗体疗效呈正 相关关系,KRAS突变合并 LKB1缺陷与 PD-1疗效 呈负相关关系[46];SERPINB3和 SERPINB4突变与 CTLA-4抗体疗效呈正相关关系。

 宿主遗传学相关的生物标志物主要与宿主免疫 基因多态性有关,包括 HLA-Ⅰ多样性和 FcγR 单核 苷酸多态性,均与ICIs疗效呈正相关关系。HLA-Ⅰ 多样性主要表现在 HLAB 和 HLAC 位点:HLAB 编 码的 MHCs能够与更多样化的 TCRs结合,HLAC 在 APCs中的表达高于其他细胞。并且,从 TMB 和 TCRs的角度考虑,HLA-Ⅰ多样性也能促进ICIs疗 效。研 究 表 明,在 黑 色 素 瘤 中,等 位 基 因 CD16AV158F编码的 FcγR 与IgG 免疫球蛋白的亲 和力增加,与 CTLA 抗体疗效呈正相关关系。 

与IME有关的生物标志物包括免疫细胞、细胞 因子 及 PD-L1。免 疫 细 胞 包 括 肿 瘤 浸 润 淋 巴 细 胞(TILs)、CD8+ T 细胞、CD4+ 记忆 T 细胞和骨髓源性 抑制细胞 MDSCs)。细胞因子主要是 TGF-β,其可以 促进CD8+ T 细胞排斥。而PD-L1作为PD-1/PD-L1 抗体的作用靶点,和 TMB都是ICIs治疗的独立预测 因子。其中,与ICIs疗效呈正相关的是 TILs、CD8+ T 细胞、CD4+ 记忆 T 细胞和 PD-L1。其余与ICIs疗 效呈负相关关系。 

此外,还有一些全身性的生物标志物也与ICIs疗 效有关,如淋巴细胞计数、单核细胞计数、Treg水平、 嗜酸性粒细胞计数、IL-6、IL-8、IL-10表达以及乳酸脱 氢酶活性等。值得注意的是,MMRd实际上会表现出 微卫星不稳定性(MSI),MSI阳性肿瘤实质是一种特 殊的高 TMB肿瘤,其会高表达 PD-1、PD-L1、CTLA- 4、LAG3 以 及 IDO1。因 此,除 PD-L1 之 外,PD-1、CTLA-4、LAG3以及IDO1也可能成为与ICIs治疗 的潜在生物标志物。 

    2.2 ICIs耐药的生物标志物     由于缺乏 MHC Ⅰ类 分子,抗原加工和提呈受干扰,在上文提到的 CRMA, 也是 CTLA-4抗体治疗耐药的生物标志物。而 SC- NAs会干扰肿瘤抗原与 MHCs的装配,也是耐药的 生物标志物之一。另外,PTEN 失活、IFN-γ信号 通路相关的基因突变,以及 WNT/β-catenin信号通路 也是ICIs耐药的生物标志物。 

    2.3 预测和诊断irAEs的生物标志物     目前普遍认为女性、身体机能状态较差以及少 肌性肥胖均是irAEs的危险因素。但也有研究表明年龄、男性和非甾体类抗炎药分别是 CTLA-4抗体引起的垂体炎和 结肠炎的危险因素。而irAEs诊断主要通过排除其 他感染、药物等原因,依赖常规的实验室指标、影像学 表征及病理学分析确定的终末器官功能障碍。若诊 断不足可能会导致不适当的毒性治疗的持续及不良 反应的加剧;相反,若过度诊断则可能导致不适当的 ICIs永久保留或终止及不适当的糖皮质激素或其他 免疫抑制剂的使用。因此,急需一些生物标志物来早 预测、早预防、早诊断、早治疗irAEs。 

预测和诊断irAEs的潜在生物标志物可分为细胞、内分泌激素、自身免疫抗体、细胞因 子及趋化因子、微生物、遗传以及影像学指标几大类。细胞类包括上文提到的Treg,低基础 Treg水平可能增加ICIs 引起的结肠炎的风险,而 CD4+ T 细胞则恰恰相反, 高基础水平反而会增加ICIs引起的结肠炎的风险,但 两者对于预测irAEs均缺乏特异度,无法将其与预测 ICIs疗效区分开。还有淋巴细胞计数、中性粒细胞与 淋巴细胞比值、嗜酸性粒细胞计数、T 细胞多样性和 CD8+ T 细胞均与irAEs的发生发展呈正相关关系。前3者虽然便宜、常用,但缺乏灵敏度和特异度;后两者价格昂贵,且对于irAEs患者个体的提示意义尚不 明确,可用性有限。内分泌激素中唯一能预测和诊断 irAEs的促甲状腺激素(TSH)和自身免疫抗体中的抗甲状腺球蛋白是与ICIs引起的甲状腺炎呈正相关 的生物标志物,且具有特异度。其他的自身免疫抗体 类生物标志物还包括 GAD65抗体、胰岛素抗原-2抗 体、锌转运体8抗体、胰岛素抗体和抗核抗体,前者是诊断ICIs引起的糖尿病的生物标志物,价格昂贵, 可用度有限;后者与irAEs发展有关,但对irAEs患 者个体缺乏特异度。

 能够预测和诊断类的生物标志物有很多ir，A可Es以的独细立胞应因用子作和为趋化因子 irAEs生 物标 志 物 的 包 括 IFN-γ、IL-6、IL-17、瘦素、可溶性 CD163和 CRP。治疗后的IFN-γ低水平提示ICIs引 起的肺炎,是其特异性指标。低基础水平的IL-6提示 ICIs引起的结肠炎,而出现irAEs后的IL-6升高提示 银屑病加重。高基础水平的IL-17提示结肠炎,但价 格昂贵,且受目前临床细胞因子检测水平的限制。治 疗后的瘦素低水平、可溶性 CD163高水平以及 CRP 表达上升均提示出现irAEs风险增加。细胞因子中 IL-8和可溶性 CD25同时低基础水平提示ICIs引起 的结肠炎风险增加,而 TNF-α和IFN-α2同时表达增 高提示严重的irAEs。当趋化因子 CXCL9、CXCL10、 CXCL11和 CXCL19联用,其低基线水平提示irAEs 风险增加;而ICIs治疗后趋化因子 CXCL9、CXCL10、 CCL5和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)均 升 高 提 示 irAEs风险增加。将 G-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺 激因子、分型趋化因子、成纤维细胞生长因子-2、IFN- α2、IL-12p70、IL-1a、IL-1b、IL-RA、IL-2 和 IL-13 联 用,进行综合评分,高基础水平评分和治疗后评分均 提示出现irAEs风险增加。 

微生物组学方面的标志物包括厚壁菌门粪杆菌属、拟杆菌和与多胺转运系统、硫胺素、核黄素、泛酸 盐合成有关的微生物代谢产物,其相关指标的基线水平上升均会增加出现irAEs的风险,而拟杆菌和微生物代谢产物相关指标是提示ICIs引起的结肠炎的特 异度 指 标。遗传学标志物 包 括 HLA-DR4 表型、CD177和癌胚抗原细胞黏附因子1(CEACAM1), HLA-DR4与ICIs引起的糖尿病有关,治 疗后的CD177和CEACAM1升高,提 示irAEs风险增加。最后是影 像学生物标志物胸部CT,其评分升高与 ICIs引起的肺炎有关,具有良好的灵敏度和特异度。

目前,经过Ⅲ期临床试验验证的生物标志物仅有 TMB和 PD-L1,虽然它们已是临床应用ICIs的常规 监测指标,但其仍有一些缺陷。在非小细胞肺癌中, 帕博利珠单抗的应答率在高水平 PD-L1表达的情况 下为45%~50%,但在无PD-L1表达的情况下其应 答率仍有 10% ~15%。并且在两个独立的CTLA4 抗体治疗黑色素瘤患者的队列研究中发 现,当SC- NAs与 TMB联用时,其对ICIs疗效的预测效果优于 TMB[50]。可见,将潜在的生物标志物最终应用于临床还有很长的路要走。而因功能障碍的终末器官不同,目前用于监测和 诊断irAE的常规临床实验室检测方法包括用于肾炎 的血清肌酐,用于肝炎的天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转 氨酶和胆红素,用于心肌炎或肌炎的肌钙蛋白和肌酸 激酶,用于胰腺炎的脂肪酶以及用于垂体炎和甲状腺 炎等内分泌疾病的肾上腺皮质营养激素、皮质醇、促 黄体生成激素、促卵泡激素、胰岛素样生长因子1、生长激素、TSH和游离甲状腺素等。但是,它们都无法 为有关毒性的病理生理学机制提供有意义的见解或 预测价值。且癌症患者治疗中常发生的肝肾功能障 碍并不是ICIs诱导的宿主免疫增强所特有的。目前, 虽然将这些常规的临床实验室检测指标作为一般推 荐,但实际上支持这些参数的最佳筛查频率的证据也 是缺乏的,而irAEs的其他生物标志物还处于早期探 索阶段。

目前,ICIs治疗已被写入各种复发性恶性肿瘤和 中晚期癌症的临床应用指南中,甚至能够跻身于Ⅰ级推荐。但由于在我国,一些ICIs尚未获得肿瘤治疗的 适应症,且相关诊断试剂获批较晚,目前仍缺乏基于 我国人群的相关研究及循证医学证据。虽然已有许 多研究表明ICIs确实对肿瘤有效且能延长患者的总 生存期,但其具体机制尚未完全阐明,对其相关生物 标志物的研究也处于早期探索阶段。随着检测技术 的快速发展、相关医学技术的突飞猛进,相信在不久 的将来,ICIs的作用机制将会进一步明确,其相关生 物标志物的研究会进一步发展,早日应用到临床指导 癌症患者用药,延长患者生存期,提高患者生活质量。

参考文献：略