1.2.1  胃癌裸小鼠移植瘤模型建立 

将处于对数生长期的SGC-7901胃癌细胞株调整至（2~3）×10⁷/mL的浓度，于每只BALB/c 裸小鼠的右前肢腋下皮下接种0.2 mL。 

1.2.2  实验分组及用药 

待移植瘤体积达到约200 mm3时，将12只裸小鼠随机分成4组：最大耐受剂量（maximum tolerated dose，MTD）组（52.5 mg/kg，每周给药2次，连续2周，停1周）、每日节拍化疗 （daily metronomic chemotherapy，MET-qd）组 （10 mg/kg，每天1次，连续6周）、隔日节拍化 疗（every other day metronomic chemotherapy，MET-qod）组（20 mg/kg，隔日1次，连续6周）和每周2次节拍化疗（twice-weekly metronomic chemotherapy，MET-biw）组（30 mg/kg，隔2 d给药1次，连续6周）。以每21天为1个疗程，共2个疗程。具体实验分组及给药方法见图1。开始用药后每周测量裸小鼠体重、肿瘤最大径（a）和与之相垂直的横径（b），肿瘤体积按照公式 V （mm³）=1/2ab²计算，绘制肿瘤生长曲线。 

1.2.3  流式细胞术检测 

外周血内皮祖细胞（circulating endothelial progenitors，CEP）数量检测：6周后处死裸小 鼠，眼眶取血，每只取100 μL外周全血，按照实验分组，每只裸小鼠均取100μL外周全血至流式管中，加入相应量的CD117、Flk-1、Sca-1单抗，MTD组加入混合血清，再加入同型阴性对照抗体，采用流式细胞术检测各组CEP数。脾脏和瘤体内浸润的免疫细胞检测：6周后处死裸小鼠，取脾脏及瘤体，用生理盐水冲净后，分别加入胶原酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ和透明质酸酶，在摇床上3℃消化1~2 h，70 mm过滤器过滤消化液，制备成单细胞悬液，加入B细胞（CD45⁺CD11b⁺）、NK细胞（CD49B⁺NK1.1⁺）、TAM（F4_80⁺CD86⁺、F4_80⁺CD206⁺）和MDSC（Ly6C⁺Ly6G⁺）相对应的抗体，上流式细胞仪检测各组相应的免疫细胞量。 

1.2.4  ELISA检测 

收集裸小鼠外周血，12 000×g离心10 min后留取血浆，按ELISA操作说明书，分别检测各组 血浆标本的血管生成相关因子［血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）］、M1型TAM细胞因子［白细 胞介素（interleukin，IL）-12］和M2型TAM细胞因子（IL-10）等。 

1.2.5  免疫组织化学染色 

用药6周后处死裸小鼠，将剥离的瘤体组织 常温下以10%中性甲醛溶液固定24 h，常温石蜡 包埋后4 μm连续切片，使用CD11c（1∶100）和 CD163（1∶200）一抗温育，在光学显微镜下每 张玻片随机选取5个视野拍照。使用Image-Pro软件对染色强度及密度进行半定量分析（表 1）。

图1  裸小鼠移植瘤实验分组及给药模式图 

Fig. 1 Experimental groups and administration methods of xenograft tumor in BALB/c nude mice

1.2.6     不良反应评价

一般状况：用药后每周观察裸小鼠饮食、活力、精神状态并测量体重。

血液学毒性：6周后处死裸小鼠时眼眶取血，行血细胞计数。

脏器毒性：6周后处死裸小鼠，留取肺、肝、心和肾脏组织进行H-E染色，由2名病理科医师独立进行切片、读片和评判。

图3   血管生成参与5-FU节拍化疗的抗肿瘤作用

Fig. 3 Angiogenesis participates in the antitumor effect of 5-FU metronome chemotherapy

A: Flow cytometry was used to detect CEP in the peripheral blood of nude mice; B: Histogram of CEP statistics in the peripheral blood of nude mice; C: VEGF concentration in the peripheral blood of nude mice; D: PDGF concentration in the peripheral blood of nude mice. SSC: Side scatter; FSC: Forward scatter. **: P＞0.05; ***: P＜0.001.

图4   TAM的极化参与5-FU节拍化疗的抗肿瘤效应

Fig. 4 Polarization of TAM is involved in the antitumor effect of 5-FU metronomic chemotherapy

A: The infiltrated TAM in the spleen and transplanted tumor of nude mice were measured; B: Polarization of TAM in spleen and transplanted tumor in nude mice; C: Expression of IL-12 in the peripheral blood of nude mice; D: Expression of IL-10 in the peripheral blood of nude mice; E: The expression of CD11c and CD163 was detected by immunohistochemistry (×200). *:P＞0.05; **: P＜0.05; ***:P＜0.001.

图5   5-FU节拍化疗裸小鼠耐受性良好

Fig. 5 5-FU metronomic chemotherapy was well tolerated in mice

A: Dynamic changes of body weight in nude mice; B: Hematological toxicity in nude mice; C-F: H-E staining results of lung, liver, heart and kidney in nude mice showed that lung interstitial thickening, lymphocyte infiltration and chronic inflammation were observed in MTD group compared with metronome chemotherapy group (×200). ***: P＜0.001

本课题组前期研究^［7］结果显示，氟尿嘧啶类药物节拍化疗可通过抗肿瘤血管生成抑制胃癌细胞体内外的增殖。本研究再次验证了以上现象，除抑制肿瘤血管生成参与5-FU节拍化疗的抗肿瘤作用外，免疫激活也作为重要环节参与其中。随着免疫治疗的快速发展，已有若干研究证实节拍化疗与免疫细胞之间的相互作用。Ghiringhelli等^［9］报道，单剂量环磷酰胺节拍化疗可导致CD4/CD25调节性T细胞的耗损。在3LL细胞的Lewis肿瘤模型中，低剂量紫杉醇通过下调Bcl-2选择性抑制调节性T细胞数量和功能，而不影响效应T细胞^［10］。环磷酰胺诱导生化性复发前列腺癌患者的调节性T细胞减少和前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）特异性T细胞活化^［11］。奥沙利铂节拍化疗通过诱导钙网蛋白的表达和HMGB1的释放刺激结肠癌细胞的免疫原性细胞死亡^［12］。节拍疗法靶向PARP-1调节MDSC的抑制功能，增强程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）抗体免疫治疗结肠癌^［13］。低剂量环磷酰胺可消耗恶性胸膜间皮瘤患者循环naïve T细胞，激活调节性T细胞，协同以树突状细胞为基础的免疫治疗^［14］。

本研究建立胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型，通过流式细胞术、ELISA和免疫组织化学等，发现TAM的极化参与了5-FU MET-qod节拍化疗的抗肿瘤作用。与MTD组相比，MET-qod组裸小鼠无论是外周还是瘤体内杀伤肿瘤细胞的M1型TAM比例均明显升高。目前关于节拍化疗与TAM在肿瘤中的研究较少，仅在三阴性乳腺癌小鼠模型中发现，新型唑来膦酸脂质体可消耗瘤体内TAM，从而提高其抗肿瘤作用^［15］。本研究结果进一步验证了TAM参与节拍化疗的抗肿瘤作用机制。

5-FU属于抗代谢类化疗药物，半衰期极短，因此经典给药方法是长时间静脉持续输注，主要不良反应为胃肠道反应和骨髓抑制。本研究发现，5-FU节拍化疗组小鼠体重无明显降低，且血液学毒性明显低于MTD组。H-E染色发现，MTD组裸小鼠肺间质增厚，呈慢性炎症表现，而节拍化疗组裸小鼠的重要脏器功能均无明显改变。以上结果提示，在给药总剂量相同的情况下，改变给药策略可在保证疗效的前提下显著减轻不良反应，若可转化应用于临床，有望更好地保护癌症患者的重要脏器功能。

改良传统化疗药物的给药模式，是在目前胃癌等实体瘤的有效药物数量有限前提下的有益探索，以克服耐药、减轻不良反应。节拍化疗是在不延长治疗间隔时间的情况下，以相对较低且毒性较小的剂量、较高频次来给予化疗药物^［16］。目前，节拍化疗在胃癌中显示出良好的应用前景。对老年晚期胃癌患者采用口服氟尿嘧啶类药物（卡培他滨）节拍化疗（1 000 mg/d，第1~28天，每5周1次）耐受性良好，且有效率不低于传统MTD给药^［17］。每周紫杉醇节拍化疗（80~100 mg/m²）可使晚期或复发的胃食管恶性肿瘤患者生存获益^［18］。低剂量卡培他滨节拍给药（1 100 mg/m²/d）联合阿柏西普对于难治性胃癌患者较MTD卡培他滨联合阿柏西普的客观缓解率明显增加（15.4% vs 7.7%）^［19］。

节拍化疗现已成为晚期或难治性肿瘤的有效治疗策略。当肿瘤治疗进入精准治疗时代，节拍化疗如何实现精准治疗尚有待探索。就氟尿嘧啶等时间依赖性药物而言，有效药物浓度的暴露时间远比根据体表面积或体重计算出的剂量重要，而目前如何精准把握节拍化疗的给药节拍尚处于探索阶段。基于以上临床治疗难点，本研究对胃癌移植瘤裸小鼠模型采用相同总剂量、不同5-FU 节拍给药模式，初步探索不同治疗模式的抗肿瘤作用。结果显示，在给药剂量相同的情况下，改变给药节拍可达到最佳抗肿瘤效应，5-FU MET- qod模式可明显抑制裸小鼠胃癌移植瘤生长。

癌细胞的生长具有周期性，因此临床给药充分利用其周期性特点择时（每2~3周）给药可以达到最佳抗肿瘤作用。节拍化疗的抗肿瘤作用并不是针对癌细胞，而是针对血管内皮细胞和（或）免疫间质细胞，因此其给药节拍与常规给药截然不同。目前节拍化疗给药节拍的确定尚缺少相关研究。本研究在裸小鼠胃癌移植瘤模型上发现，低剂量5-FU MET-qod具有最佳的抑瘤作用，但其抑制血管的效应并不是最强，可能与该给药节拍能更好地抑制TAM由M1向M2的转化有关。

综上所述，5-FU MET-qod可达到最佳的抑制胃癌裸小鼠移植瘤生长的作用，且耐受性良好， 其作用机制一方面通过抗肿瘤血管生成，另一方面通过调节TAM的极化。上述结果可能有助于设计相关临床研究，以探索氟尿嘧啶类药物的最佳抗肿瘤给药模式，提升胃癌总体疗效，以及进一步提高患者的生活质量。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。