肝癌的发病率和死亡率在癌症中居前列，全球每年新诊断病例超过90万，死亡人数超过80万。90%的肝癌病例是肝细胞癌 (HCC)，病人的存活率在很大程度上取决于诊断时的疾病分期。当肿瘤处于定植期（localized），五年生存率为34%，占患者总数的44%；侵袭期（regional）五年生存率为12%，占患者总数的27%；发现远处的病灶时即转移期（distant），患者的五年生存率为3%，占患者总数18%。全世界有3.5亿人患有慢性病毒性肝炎感染，5000万人患有肝硬化，这些人群的肝癌风险增加。高风险人群的筛查目前采用带或不带甲胎蛋白 (AFP) 的腹部超声成像，筛查灵敏度从47%-84%不等，特异性从67%-90%以上不等。因此，非常需要开发可用且灵敏的非侵入性HCC筛查方法。
近日，美国约翰霍普金斯大学研究团队开发出一种基于血液的全基因组cfDNA片段化特征检测方法，为HCC检测提供了一种高性能且具有成本效益的可行选择。该研究结果发表在Cancer Discovery上，题为“Detecting liver cancer using cell-free DNA fragmentomes”。研究人员分析了HCC患者中cfDNA的分子来源，并确定了与片段化变化相关的基因组和染色质特征。
研究人员检测了501名个体的血浆样本，来源于75名HCC患者和426名非癌症患者。在非癌症的个体中，133人患有会增加HCC风险的疾病，包括各种原因引起的肝硬化或无肝硬化的病毒性肝炎。研究团队利用0.5-5ml血浆生成基因组文库，并对cfDNA片段进行低覆盖率全基因组测序（~2.6倍覆盖率），每个样本平均有4900万个高质量配对reads，包含9Gb的序列数据。
同时，研究团队还检测了223名来自香港患者的全基因组序列数据作为验证队列，包括可切除的早期HCC（(n=90, a期85,B期5）、HBV (n=66)和乙肝相关肝硬化（n=35），以及无肝病的健康个体（n=32）。
研究人员评估了cfDNA片段谱并在473个非重叠的5MB区域中生成了整个基因组的片段谱，每个区域包含约80,000个片段，并使用DELFI方法跨越大约2.4GB的基因组。结果显示，cfDNA片段谱在无癌个体中是一致的，HCC患者中存在较大的差异（图1A）。 与HCC患者相比，肝硬化患者的特征更接近于未患肝硬化的非癌症个体（图1A）。病毒性肝炎患者的片段谱与无肝病的非癌症个体几乎相同（图1A）。
为了研究cfDNA片段化模式的起源，研究人员将全基因组片段组图谱与高通量测序染色体构象捕获（Hi-C）开放（A）和封闭（B）区室进行了比较，发现健康个体的cfDNA片段化模式与淋巴母细胞高度相关（图 1B）。相比之下，无癌个体的概况更接近淋巴母细胞的A/B区室（图1B、C）。以上分析表明，来自HCC患者的cfDNA片段组代表了外周血细胞和肝癌细胞染色质区室的cfDNA图谱的混合。
图1. 全基因组片段谱反映了潜在的染色质结构。来源：Cancer Discov
3.从全基因组cfDNA片段推断疾病特异性转录因子
研究团队分析了cfDNA片段化特征是否可能反映了肝癌中转录因子（TF）的DNA结合改变引起的变化。研究团队比较了HCC患者与无癌个体的TF，以确定在cfDNA中全基因组结合位点覆盖率差异最大和最小的TF（图2A、B）。使用基因疾病关联的DisGeNET数据库进行的基因集富集分析显示，预计HCC和无癌个体之间的cfDNA TF结合覆盖率差异与HCC和其他癌症相关（图2C、D）。对HCC患者的cfDNA片段化数据进行类似分析，显示与HCC相关的转录因子结合位点的覆盖范围差异有所增加（图2C、E）。以上结果表明，HCC和其他癌症患者的cfDNA片段化变化是由癌细胞中存在的大量转录谱改变引起的。
图2. HCC患者的片段化谱突出了肝脏特异性转录因子。来源：Cancer Discov
3.DELFI利用cfDNA片段组揭示HCC的基因组变化
鉴于HCC的基因组和染色质变化与cfDNA片段化之间的直接联系，研究人员使用机器学习方法确定了cfDNA片段组的变化是否可以区分HCC患者和非癌症患者，构建了DELFI模型。结果显示该机器学习模型，检测癌症的敏感性在平均风险人群中为88%，特异性为98%，在高危人群中为85%，特异性为80%。除了利用在HCC患者中观察到的染色质和转录因子变化导致的全基因组片段化谱外（图3A），该模型分析还揭示了与HCC中常见的获得或丢失的匹配染色体臂的表征改变，例如之前报道的HCC的TCGA大规模基因组研究（n = 372）（图3B）。
图3. 片段化特征反映了HCC生物学，并被纳入DELFI机器学习方法中。来源：Cancer Discov
接下来，研究人员检查了DELFI评分与高危人群中HCC发生和分期之间的关系。133名非癌症个体的DELFI分数较低，病毒性肝炎或肝硬化患者的DELFI分数中位数分别为0.078或0.080。相比之下，75名HCC患者在所有阶段的DELFI中位数得分显著更高（图4A）。用于识别HCC患者的DELFI方法的特征（ROC）曲线显示，在高风险个体中，曲线下面积（AUC）为0.90（图4B）。早期HCC的表现仍然稳健，晚期HCC个体几乎完全被检测到（AUC>0.97）（图4C）。在亚洲人验证队列中，DELFI模型可将AUC为0.97的HCC患者与高危个体区分开来（图 4D），表明cfDNA片段化的基本特征在该队列中相似，并且DELFI是检测HCC的可靠方法，或可在不同高危人群中推广。
图4.DELFI机器学习模型以高灵敏度和特异性检测HCC。来源：Cancer Discov
研究团队开发的全基因组cfDNA片段化特征检测方法对HCC具有高灵敏度和特异性。研究表明片段化概况捕获了基因组和染色质特征，包括已知在HCC中很重要的改变。cfDNA片段化组分析方法“DELFI”是第一个在单独的高风险人群中独立验证的全基因组片段化分析，在检测HCC方面具有稳定和强大的性能，包括非常早期的疾病，且与疾病病因无关。
该研究结果还表明，疾病特异性转录因子特征可以通过全基因组cfDNA片段谱进行分析。利用全基因组cfDNA片段分析疾病特异性转录调控，可能改善癌症患者起源组织的检测和识别。随着患者数量的增加，cfDNA转录谱可以进一步改进机器学习算法来检测HCC和其他癌症。
Foda, Z. H., Annapragada, A. V., Boyapati, K., Bruhm, D. C., Vulpescu, N. A., Medina, J. E., ... & Velculescu, V. E. Detecting liver cancer using cell-free DNA fragmentomes. Cancer Discovery,(2022). https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-22-0659
https://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article/doi/10.1158/2159-8290.CD-22-0659/711014/Detecting-liver-cancer-using-cell-free-DNA
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