肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌的最常见形式，通常发生在患有慢性肝病（主要是肝硬化）的患者中。目前从肝硬化到非典型性增生和早期HCC（eHCC）恶性转化的分子事件了解甚少。DNA甲基化是一种广泛的表观遗传修饰，DNA（CpG岛）甲基化异常在许多癌症发展的早期就已经发生，但是已有的研究都专注于肝癌患者的甲基化异常，而肝脏在恶性转化过程中的DNA甲基化改变仍然未知。
近日，西奈山伊坎医学院科研团队分析了肝癌发生的不同组织学阶段的全基因组DNA甲基化水平变化。研究涵盖了来自248名患者的390个组织标本（包括HCC、肝硬化、非典型性增生和正常肝脏组织样本），并通过整合基因表达数据，确定了新的肝癌发生表观遗传标志物。此外，该研究还描述了肿瘤邻近肝硬化组织的DNA甲基化水平变化后区分HCC患者。研究结果发表在Hepatology杂志上。
文章发表在Hepatology上
研究人员使用Illumina Infinium HumanMethylation 450芯片阵列对248名患者的390个样本（本次检测144个样本，结合之前已研究的246例）进行全基因组甲基化分析，检测涵盖96%的已知CpG岛。390个样本包括16例正常肝组织样本，139例肝硬化样本，8个非典型性增生结节样本（包括6个低级别和2个高级别非典型性增生结节）和227个HCC组织样本（43个为小于2cm的小肿瘤（即早期肝癌），184个为大于2cm的肿瘤（即进展期肝癌））。
结果表明，HCC组织与正常组织的甲基化水平差异最大。肝硬化、非典型性增生和HCC组织与正常组织相比，甲基化水平逐渐增高。表明根据显著的甲基化水平逐步变化，可以将正常肝脏与病变组织区分开来。
每种组织（正常，肝硬化，非典型性增生和HCC）两两之间的差异甲基化分析显示，肝硬化和HCC之间的差异甲基化区域（DMR）数量最多，其次是正常样本与HCC样本。
图1. 每种组织类型的差异甲基化区域（DMRs）比较。来源：Hepatology
该研究试图找出从肝硬化组织到非典型性增生结节直至形成小的HCC组织这一过程中甲基化水平的改变。研究鉴定了30个潜在的表观遗传标志基因，并将这些基因启动子处甲基化与基因表达进行关联，发现TSPYL5、KCNA3、LDHB和SPINT2基因在甲基化水平和表达之间存在显著的负相关关联。这些基因参与TP53，cAMP，丝氨酸蛋白酶和NADH调控。这4个基因的甲基化水平异常在两个外部数据集中也得到了验证。
图2. 肝细胞癌甲基化标志物（KCNA3, LDHB, SPINT2和TSPYL5）的选择标准和细节。来源：Hepatology
研究人员评估了癌旁肝硬化组织是否存在不同的分子亚类。研究纳入了130名来自邻近非肿瘤组织的DNA甲基化患者样本（94%的肝硬化组织样本）。研究利用Kmeans聚类分析将患者分成M1和M2两类，分别包含55名和75名患者。
与M2类相比，M1类中有31,198个CpG位点低甲基化，10,7187个CpG位点超甲基化。通过分析两组患者的生存率数据，发现M2类患者的总生存期较短（平均生存期，51.9个月vs 60.1个月），说明癌旁肝硬化组织中的DNA甲基化水平具有预测预后的潜力。比较M1和M2类患者中一些重要的临床指标，研究人员发现M2中更易出现HCV（61％vs 22％），同时，M2类患者的血清胆红素水平更高（1.2 vs 0.8 mg / dl），血小板计数更低（122 vs 178 /mm³），肿瘤结节更小（3.5 vs 5 cm）。两组之间的年龄、性别、肿瘤分期、组织病理学肿瘤分级、血管浸润或结节情况、血清AFP水平以及根据Child-Pugh分类的肝功能均没有差异。
图3. M1与M2集群的总生存率存在显著差异。来源：Hepatology
DNA甲基化差异分析发现，肝硬化组织的M1和M2类之间有31,957个CpG位点的甲基化水平存在差异。差异甲基化基因的代谢通路富集分析表明，在M2类中，CD4+ T细胞应答和分化途径的自噬和免疫激活增加，M1类显示胆固醇代谢和神经活性配体-受体相互作用的甲基化水平降低。与M1类相比，M2类有更高的表达和更低的甲基化谱。基因表达结果的富集分析显示，抑制性白细胞介素基因IL10在M1中表达上调，可能与它减少炎症反应并导致细胞浸润和分化减少的功能相关。单样本基因集富集分析显示，M2类与免疫、炎症、细胞信号和增殖信号的富集有关，包括一些癌症特征信号，以及与M1类相比肝癌预后更差的信号。同时，与M2类相比，M1类与代谢信号的富集有关。以上结果与差异甲基化结果一致，说明与M2类相比，M1类的胆固醇相关通路基因甲基化水平降低，免疫和炎症途径相关基因的甲基化水平升高。
图4. 聚类分析M1和M2组DNA甲基化和基因表达差异。来源：Hepatology
该研究进行了全面的全基因组DNA甲基化分析，涵盖了从正常肝组织和肝硬化，到非典型性增生结节，到肝癌早期和进展中肝癌的整个甲基化发生图谱。
在分析DNA甲基化数据时，研究发现正常肝组织和HCC之间的差异最大。与非恶性组织相比，HCC样本在DNA甲基化变化方面积累了最高的变异性。在正常、肝硬化、非典型性增生和HCC之间观察到的DNA甲基化变化梯度可以准确区分肝癌发生过程中的不同组织学阶段，并报告了4个基因（TSPYL5、KCNA3、LDHB和SPINT2基因）可以作为从癌前病变过渡到早期HCC的候选新表观遗传学标志物。
Hernandez-Meza, Gabriela et al. “DNA methylation profiling of human hepatocarcinogenesis.” Hepatology (Baltimore, Md.), 10.1002/hep.31659. 25 Nov. 2020, doi:10.1002/hep.31659
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